細胞在發(fā)生凋亡時，會激活一些DNA內(nèi)切酶，這些內(nèi)切酶會切斷核小體間的基因組DNA?；蚪MDNA斷裂時，暴露的3'-OH可以在末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶(Terminal Deoxynucleotidyl Transferase, TdT) 的催化下加上熒光素 (FITC) 標記的dUTP (fluorescein-dUTP)，從而可以通過熒光顯微鏡或流式細胞儀進行檢測。
病理檢測
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Tunel
? 服務介紹
石蠟切片→脫蠟至水→修復→破膜→阻斷內(nèi)源性過氧化物酶→加反應液→顯色→復染細胞核→封片鏡檢
? 實驗步驟
1.蛋白酶 K 修復：切片稍甩干后用組化筆在組織周圍畫圈（防止液體流走），在圈內(nèi)滴加蛋白酶 K 工作液覆蓋組織，37 度溫箱孵育 20min。將玻片置于 PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌 3 次，每次 5min。(蛋白酶 K 工作液配置方法，原液：PBS=1:9)
2.（可選步驟）破膜：切片稍甩干后在圈內(nèi)滴加破膜工作液覆蓋組織，常溫下孵育 20min，將玻片置于 PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌 3 次，每次 5min。
3.阻斷內(nèi)源性過氧化物酶：將玻片置于 PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌 3 次，每次 5min。在圈內(nèi)滴加內(nèi)源性過氧化物酶阻斷劑，室溫避光孵育 20 min，將玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌 3 次，每次 5min。
4.室溫平衡：切片稍甩干后在圈內(nèi)滴加 buffer 覆蓋組織，buffer 常溫孵育 10min。
5.加反應液： 去掉平衡液，按片子數(shù)量和組織大小取 tunel 試劑盒內(nèi)適量 RecombinantTdT enzyme，Biotin-dUTP Labeling Mix，Equilibration Buffer，按 1 μL：5 μL：50 μL 比例混合，加到圈內(nèi)覆蓋組織，切片平放于濕盒內(nèi)，37℃溫箱孵育 1 小時，濕盒內(nèi)加少量水保持濕度。
6.加 Streptavidin-HRP 反應液：將玻片置于 PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌 3次，每次 5min。 Streptavidin-HRP 和 TBST 按 1：200 比例混合，加到圈內(nèi)覆蓋組織，切片平放于濕盒內(nèi)，37℃溫箱孵育 30min。將玻片置于 PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌 3 次，每次 5min。
7.DAB 顯色：切片稍甩干后在圈內(nèi)滴加新鮮配制的 DAB 顯色液，顯微鏡下控制顯色時間，陽性為細胞核呈棕黃色，純水沖洗切片終止顯色。
8.復染細胞核：蘇木素復染 6min 左右，自來水洗，1%鹽酸酒精分化 1-2 秒，自來水洗，1%氨水返藍，自來水洗。
9.脫水透明封片：將切片依次放入 65%乙醇 1min-75%乙醇 1min-85%乙醇 1min -95%乙醇-無水乙醇 1min -二甲苯Ⅰ 5min 中脫水透明，將切片從二甲苯拿出來稍晾干，中性樹膠封片。
10.結(jié)果觀察：蘇木素染細胞核為藍色，DAB 顯出來的陽性凋亡細胞核為棕黃色。
? 結(jié)果展示
